Маркер флуоресцентный, которая разработана на основе в области регулирования гена Креспо рыб Данио-рерио, группа ученых из США, Швейцарии и Германии проследила первых этапах создания и развития меланомы. Из множества клеток, которые относят онкогенные мутации, только некоторые могут дать начало раковой опухоли. Так, геном меланоцитов, многие доброкачественные опухоли родинки или бородавки (невусов) имеют онкогенную мутацию BRAFV600E, но эти невусы очень редко превращаются в меланому. Оказалось, что при возникновении злокачественной опухоли отдельных меланоцитов перепрограммируются на состояние ваших ранних эмбриональных предшественников. Также удалось определить факторы транскрипции и реорганизации хроматина, связанные с преобразованием предрасположенность к раку доброкачественных клеток в злокачественные опухоли.
Генетический аппарат клеток обладает сложной системой контроля деления, роста, дифференциации и гибели клеток. Нормальное протекание этих процессов, в том числе предотвращения неконтролируемого роста клеток и образование опухолей, действуют в основном два типа генов паука, адресованные функции — протоонкогенами, которые стимулируют рост клеток, и антионкогенами (генами-супрессорами опухолей), тормозит избыточный рост (более подробная информация об онкогенах и антионкогенах, Новости На пути детального каталога раковых генов, «Элементы», 06.04.2015). Известно, что причиной появления раковых клеток и опухолей в целом и меланомы в частности, являются мутации, активирующие протоонкогены и/или инактивирующие гены-супрессоры опухолей. Эти ключевые события, канцерогенный (см. генетические аспекты канцерогенеза) уже достаточно хорошо изучены. Но в процессе онкогенеза, которые происходят и другие молекулярные события, которые участвуют механизмы, перепрограммирующие нормальных клеток в раковые клетки. Остаются еще не изучены.
Меланома является одним из очень агрессивных рак — возникает в результате злокачественного перерождения меланоцитов, клеток кожи, которые производят пигмент меланина. Для изучения ранних событий, которые происходят во время формирования меланомы, авторы общей работы проводил эксперименты в рыбу Данио-рерио (Danio rerio). Эти рыбы, вместе с мышами являются излюбленным модель объекта исследования в эмбриологии и молекулярной биологии позвоночных.
В лаборатории ранее были получены Данио трансгенные, носителями мутантного активированный протоонкоген человека BRAFV600E, которая часто обнаруживается в опухолях пациентов с меланомой. Выражение BRAFV600E следил промоутер mitfa, который работает только в меланоцитах. Если в геноме рыб также отсутствовал активный антионкоген р53 (более подробно см. в разделе Новости На пути детального каталога раковых генов, «Элементы», 06.04.2015), в его теле появилось родинок и бородавок (невусы) и через несколько месяцев были разработаны меланомы. Но, несмотря на наличие многочисленных невусов, меланомы, развивалась только в некоторых из этих ракоопасных» участков. Таким образом, авторы считают, что для образования меланомы играют важную роль и другие молекулярные события, и занялись его исследованием.
Ранее с помощью гибридизации in situ было показано, что в меланомах опять начинает экспрессироваться ген рыбы Данио-рерио, crestin, что зрелому организму не свойственно. Функция этого гена и его продукта еще не уточнил, но известно, что в процессе эмбриогенеза вашего продукта, бренда, клетки-предшественники из нервного гребня (neural crest progenitors, NCP), из которого развиваются меланоциты, и исчезает через 72 часа после оплодотворения. Эти данные привели исследователей разработать ген-репортер в основе регулирования элементов ген вьющихся волос и использовать его для изучения ранних этапов формирования меланомы. Указали регуляторных элементов гена в составе довольно большой фрагмент ДНК (4,5 тысяч пар нуклеотидов, п. н.), в сочетании с геном интенсификации зеленый флуоресцентный белок (Enhanced green fluorescent protein, EGFP) и ввели эту конструкцию в геном Данио с помощью методов генной инженерии (рис. 2).
Рис. 2. Локус Креспо и разработаны на основе их регуляторных элементов флуоресцентных репортеров. В верхней части — локус Креспо (прототип). Показано расположение LTR-же последовательности нуклеотидов, U3-промотороподобной последовательности и последовательности гена для вьющихся волос, которая кодирует белок. ORF (Open reading frame) — рамки, чтения, LTR (Long terminal repeat) — длинный конец повтора. Ниже фрагменты длиной 4,5 тыс. ед. н. и 1 тыс. ед. н., используемые для дизайна репортеров — рекомбинантных активаторов гена Креспо:EGFP. Белый фрагмент стрелка — минимальный промотор гена бета-глобина (см. Бета-globin). Рис. заголовок статьи в Science
Было показано, что выражение EGFP с этот элемент искусственного точно воспроизводит выражение гена crestin в эмбриогенезе Данио-рерио, и, в частности, марки стволовых клеток и клеток, которые обеспечивают формирование нервного гребня эмбриона и меланоцитов. Введение этот журналист позволил зафиксировать визуально Данио рождения и развития меланомы (Данио-рерио, на ранних стадиях развития являются полностью прозрачными для видимого света, и это делает его легким для моделирования тела для исследования с использованием флуоресцентных меток). Удалось наблюдать один флуоресцирующие клетки, задолго до образования из них морфологически представляют опухоли (рис. 1). При трансплантации шкалы с уникальными флуоресцирующими клетками в других частях тела Данио из них были разработаны меланомы, прораставшие в гиподерму (нижний слой кожи). Таким образом, только те клетки, которые уже были промоутерами опухоли.
Рекомбинантный журналист (промотор гена от crespo:EGFP) позволило углубить молекулярных механизмов трансформации потенциально онкогенных клеток в злокачественные опухоли. Во-первых, авторы определяют минимальное количество ДНК, несущей все элементы регуляторов гена Креспо штамп ранее фрагмент длиной 4,5 тыс. ед. н. Отрезав излишки, удалось снизить сначала до 1 тыс. ед. н. (рис. 1), а затем до 296 р. н. (рис. 3). Биоинформатический анализ структуры этой части длиной 296 p. n. нашел в себе последовательности нуклеотидов, которые являются участками связывания (Binding site) факторов транскрипции. В этих областях ген-репортер вводят инактивирующие мутации и увидел выражение EGFP под контролем мутантов сайтов, с развитием эмбриона Данио.
Серия экспериментов позволила установить степень важности различных сайтов связывания, и, следовательно, факторы транскрипции, которые регулируют выражение гена crestin в эмбриогенезе. Таким образом, дефект узла сопряжения pax3 выражение гена вьющихся волос практически не влияет, и недостатки, сайтов, sox10, tfap2 и E-box сильно подавлены (рис. 3). Эти результаты показывают, что экспрессия журналист регулируется факторами транскрипции, распространенные в развитии нервного гребня.
Рис. 3. Мутации в зонах, что признание факторов регуляции транскрипции, sox10, tfap2 и E-box/ТУС (mitf), связанных с эмбриогенезом нервной Виейра, существенно снижают уровень конкретного выражения репортера (промотора гена Креспо:EGFP) длина 296 p. n. в эмбрионах через 24 часа после оплодотворения. Мутации в гипотетическом сайте pax3 в ней практически не влияют. В экспериментах по трансплантации был использован в 80-х и более эмбрионов. Набор впрыски с репортером ubi:mCh проводилась мониторинга успешности трансплантации. Справа показана доля эмбрионов с типом выражения журналиста Креспо:EGFP длина 296 p. n. Ectopic — без выражения. Neural Crest — конкретное выражение нервном гребешке. NC+tec — смешанное выражение. Рис. заголовок статьи в Science
Анализ спектра и уровня экспрессии ряда генов на ранних EGFP+-участки с помощью гибридизации на чипах, с подтверждением количественной ПЦР с обратной транскрипции показал, что с возникновением меланомы появляются молекулярные события и профиль экспрессии генов, характерные для предшественников нервного гребня (NCP). Искусственный амплификации генов, sox10 в меланоцитах экспериментальных Данио резко ускоряет возникновение и развитие меланомы, и его подавление замедляли эти процессы.
Она также изучала регуляции экспрессии генов гребня нервной системы эмбриона на эпигенетическом уровне (то есть, вызванных механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК; в этом случае, изменения хроматина) и связан с такого, в зарождающейся меланоме. Участков хроматина с высоким содержанием гистона H3 (Histone H3), ацетилированного о K27 (H3K27Ac) (см. модификации гистонов, изменения to histones), известных как суперэнхансеры (Super-enhancer,). Они связываются с основными факторами транскрипции, которые регулируют экспрессию генов, специфичные для данного типа клеток или раковых клеток.
Для характеристики суперэнхансеров применили методику иммунопреципитации фрагментов хроматина с антителами к Н3К27Ас и последующим качественным и количественным определением нуклеотидной посдедовательности ДНК в преципитированных сегменты. Для анализа профиля генов, открытых для улучшения выражения, применили метод ATAC-секвенирования (ATAC-seq). Результаты, полученные с помощью обоих подходов, показали сходство набора активно экспрессирующихся генов на ранних стадиях развития меланомы и образование нервного гребня (рис. 4).
Рис. 4. Модель начало меланомы, как следствие, «возвращение» меланоциты в состояние предшественников нервного гребня (NCP) в результате активации super-энхансеров (Super-enhancer,). В нормальной ткани происходят события генетические, которые приводят к активации онкогенов (BRAFV600E) и инактивации супрессоров опухолей (р53–/–). В результате преодолеть «барьер нормальности» и «ракоопасные» области. В этих областях отдельных клеток превышает другой барьер — возвращаются в состояние предшественников нервного гребня (NCP) и вызывает образование меланомы. Подавление процесса возвращения медикаментозными или другими средствами можно заблокировать начало меланомы. Рис. заголовок статьи в Science
Таким образом, показано, что, помимо мутации протоонкогенов и антионкогенов, дополнительным важным событием для начала меланомы является возвращение меланоциты, клетки в состояние эмбриона и его предшественники (рис. 5).
Рис. 5. Обновление меланоцитов, что приводит к злокачественной трансформации клеток. В процессе развития эмбриона рыбы Данио в предшественников нервного гребня (NCP), возникает, выражение гена Креспо (отмечен зеленым цветом), которая регулируется специальным набором факторов транскрипции. Затем NCP мигрируют и превращаются в меланоциты (серые), в которых выражение гена для вьющихся волос останавливается. В модели Данио BRAFV600E/р53–/–-меланоциты экспрессируют онкоген, но лишь немногие из них снова начинают экспрессировать Креспо и дают начало инвазивной меланоме. Это происходит в результате случайного обратного перепрограммирования, в котором из-за активации суперэнхансеров некоторые из основных генов эмбриогенеза меланоциты, которые несут онкогены, «вернуться» в состояние, подобное NCP. Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Science
Возможно, подобные события происходят при развитии многих видов рака. Упоминается о реструктуризации, в принципе, открывает новые возможности для диагностики заболеваний и для поиска новых мишеней противораковой терапии, с тем, чтобы блокировать этот процесс. Однако, ряд важных вопросов остаются без решения. Например, какое значение для начала опухоль имеет формирование его специфического микроокружения («ниши»), и как оно происходит? Также важно, что этот маркер флуоресцентный следить, как меланома превращается в инвазивную опухоль, что и другие факторы транскрипции, эпигенетические регуляторы и сигнальные пути могут быть необходимы для инициации и прогрессии опухоли. Также следует отметить, что аналоги ген вьющихся волос Данио-рерио, ни мышей, ни человека пока не найдены. Обнаружение этих маркеров эмбриогенеза позволило бы детально изучить ранних стадиях опухоли в человека.
Источники:
1) Charles K. Kaufman, Christian Mosimann, Zi Пэн Фан Сун-Янг, Эндрю Дж. Томас, Жюльен Ablain, Джастин. Л. Морено, Рейчел У. Fogley, Ellen van Rooijen, Elliott, J. Hagedorn, Christie Ciarlo, Richard M. White, Доминик A. Matos, Ann-Christin Съемника, Кристина Santoriello, Эрик C. Liao, Ричард А. Янг, Леонард I. Zon. В zebrafish меланомы model reveals emergence of neural crest identity during меланомы initiation // Science. В 2016 году. DOI: 10.1126/science.aad2197.
2) Soufiane Boumahdi, Седрик Blanpain. Tracking the origins of tumorigenesis // Science. В 2016 году. 51. P. 453-454. (Популярный Синопсис к обсуждаемой статье в Science.)
Вячеслав Калинин