Рубрики Генетически модифицированные растения, защищенные от насекомых-вредителей, безвреден для других животных, бактериальных инфекций, токсинов, позволяют увеличить производительность, но ненадолго: насекомые быстро приспосабливаются к токсинам. Чтобы на равных участвовать в гонке вооружений эволюционной борьбы с вредителями, вы должны научиться разрабатывать новые токсины, которые обладают таким же узким действие. Американские биоинженеры изобрели методику, которая позволит в кратчайшие сроки получать уведомления о новых токсинов, опасных только для определенной группы насекомых. Методика основана на быстрой эволюции вирусов, бактериофагов, построены таким образом, что для выживания, был необходим белок, который обладает необходимыми человеку свойствами.
Использование генетически модифицированных растений в сельском хозяйстве постоянно растет, несмотря на сохранение некоторых людей предрассудки и необоснованные страхи (см.: Александр Панчин. Сумма биотехнологии. На сегодняшний день одним из самых простых и наиболее перспективных подходов для повышения производительности является введение в геном растения генов из бактерии Bacillus thuringiensis, кодирующие белок, токсины, которые вредны для определенных групп насекомых и больше никого. Эти токсины, в совокупности называемые Bt-токсинов, которые связываются с рецепторами на поверхности клеток средней кишки насекомого и приводит к образованию отверстий в клеточных мембран, что приводит к гибели клеток, а затем и на насекомое. Каждый Bt-токсин, признает только «свой» приемник и, следовательно, безопасной для животных, что в этом ресивере нет.
ГМ-растения с функцией гены Bt-токсинов используются в хозяйстве около 20 лет. На сегодняшний день засеяно 420 млн. гектаров, Его использование существенно повысило производительность сельского хозяйства (см.: Трансгенный хлопок помог Китай крестьянам победить опасного вредителя «Элементы», 20.09.2008).
Тем не менее, насекомые быстро адаптируются практически любые загрязнения, в том числе Bt-токсинов. Устойчивых насекомых начинают появляться через 5-6 лет после введения нового трансгенного сорта, а иногда и еще быстрее. Чтобы не проиграть в гонке вооружений эволюции, необходимо развивать «применение эволюционной биологии» (см.: Насекомыми-вредителями, защищенных от биологического оружия, «Элементы», 08.10.2007).
Уже разработаны несколько стратегий, чтобы остановить распространение устойчивости в популяциях насекомых-вредителей. Одним из подходов, возделывать небольшие участки земли без защиты растений, что в этих местах выбор благоприятствовал насекомых, не имеют средств защиты против яда. Тот факт, что сопротивление яду, как правило (но не всегда) сопровождается негативными побочными эффектами, поэтому в конкурсе не отравленных растений, устойчивых насекомых теряют нестабильной. Но это требует от фермеров, определенный уровень грамотности и даже альтруизм: не все согласны конвертировать часть вашего участка питомник для вредителей. Другой подход-это то, что завод производить сразу несколько разных токсинов, против тех же вредителей. Наконец, можно просто часто менять, токсины. Но где взять столько токсинов, каждый из которых также должен иметь узконаправленным действием и не повредить никому, кроме определенной группы насекомых?
Американские биоинженеры из Гарвардского и Корнелльского университетов, а также компании Монсанто, опубликованной в журнале Nature статью, в которой описывают новый хитроумный метод, который позволяет путем имитации эволюции быстро получить новые модификации Bt-токсинов требованиям свойства.
На поверхности клеток кишечника насекомых есть много потенциальных мишеней для Bt-токсинов (различных белков-рецепторов), но не все они используются, существующих в природе, Bt-токсины. Таким образом, можно попытаться изменить часть аминокислотной последовательности токсина, которая служит для распознавания приемника-белый, для, что токсин начал общаться с другой приемник. В остальной части токсина можно оставить без изменений. В результате, возможно, получим новый токсин, который будет более эффективно разрушать мембраны клеток кишечника, но устанавливаться будет на других поверхностных белков этих клеток. Известно, что устойчивость насекомых к Bt-токсинам, как правило, развивается за счет мутаций, которые изменяют, соответствующий поверхности белка, либо вообще ничего, отключающих его выражение (не много белков-рецепторов жить можно, но с продырявленными клетки эпителия кишечника — не может). Таким образом, изменяя специфичность токсина (заставить признать другого приемника), можно преодолеть, порожденные устойчивости насекомых.
Но, как изменить специфичность токсина? Для этого требуется не один и даже не два, а много замен аминокислот. К сожалению, современные знания о связи аминокислотной последовательности белка с его функциональные возможности еще не являются достаточными для принятия и оформления белка на бумагу или в компьютер. Таким образом, лучший способ по-прежнему «дарвиновская эволюция в пробирке», то есть, случайные мутации и отбор. Природа ведь тоже не смог придумать ничего лучше. Тот же принцип используется и иммунной системы позвоночных, для выработки специфических антител, избирательно связывающихся с заданным антигеном (см.: Мутагенез в лимфоцитах — результат целенаправленного изменения ДНК и последующей «неточной починки», «Элементы», 03.09.2007).
Для получения новых токсинов, авторы изменили недавно изобретенной технологии «непрерывной эволюции, с помощью фагов» (phage-assisted continuous evolution, PACE, см: Kevin M. Esvelt, Jacob C. Carlson & David R. Liu, 2011. A system for the continuous directed evolution of biomolecules). Суть метода PACE в том, что бактерии наносят небольшой хромосомы (плазмиду, на рис. 1 установлен с буквами AP), которая содержит ген вирусного белка pIII (M13 ген III). Этот белок необходим для размножения вируса бактериофага. При этом регулирующий этот ген конструируют таким образом, чтобы ген активируется только в случае короткозамкнутым ротором, с определенными свойствами (Evolving protein в рис. 1). Затем бактерии заражают бактериофагами (SP), которые не имеют своего собственного гена pIII. В геноме фагов вставляется деталь: ген же «эволюционный белка», что следователи хотят изменить путь искусственной эволюции (Evolving гена). Все, что происходит в проточном резервуаре постоянного приема новых бактерий, которые вымываются оттуда быстрее, чем приходят размножаться. Бактериофаги, однако, размножаются быстрее бактерий, таким образом, в системе PACE развиваются только вирусные гены, но не бактериальной, а не плазмиды. Селективное преимущество получают те фаги, чей «эволюционный ген» обеспечивает более эффективное производство белка pIII, закодированы на плазмиде AP. Для регулирования скорости мутагенеза в клетках бактерий был добавлен еще один плазмид, MP. Содержит генетической конструкции, которая позволяет регулировать темп мутирования, изменение концентрации сахара арабинозы в среде.
Основным преимуществом этой технологии является возможность выполнять искусственную эволюцию в автоматическом режиме в течение многих поколений подряд. До сих пор, развитие новых белков методом искусственной эволюции, как правило, требует вмешательства человека на каждом шагу: сначала размножить исходный ген, внося в него случайные мутации, затем синтезировать протеины, выбрать, лучший, отсеквенировать его гена, еще раз размножить с мутациями и т. д., этот Процесс является очень трудоемким, и поэтому часто ограничивалось лишь несколько поколений designs. Между тем, для эволюционных изменений необходима, как правило, много поколений. Ранее можно автоматизировать частично искусственная, эволюция рибозимов (см.: Эволюция под управлением компьютера, «Элементы», 12.04.2008), но в эволюции белков этой технологии, и передать трудно. То, что биологи теперь могут принуждать вирусы, быстрее, эволюции репликаторы в природе — в автономном режиме «изобрести» человека белки, это, несомненно, впечатляющее достижение.
Тем не менее, система PACE до сих пор не использовалась для получения белков, избирательно связывающихся с другими белками.
Авторы поставили целью получения новой модификации широко используется в генной инженерии Bt-токсина Cry1Ac, что общался с приемником TnCAD бабочки металловидки серый (Trichoplusia ni, см: Cabbage looper) — опасного вредителя. Природный токсин Cry1Ac, бактерии Bacillus thuringiensis, не связывается с рецептором TnCAD, и бабочки Т. не было времени развить резистентность к данному токсину.
Система PACE был изменен следующим образом (рис. 1). В геноме бактериофага (SP), как «эволюционный ген» вставлен ген белка, который представляет собой участок токсина Cry1Ac, которая служит для распознавания приемника хозяйской клетки, к которой подключен один из частей (подразделений) бактериальной РНК-полимеразы. В плазмиду AP перед что геном белка pIII (что, как мы помним, необходим для размножения вируса) вставлен регулирующий область, которая содержит участок ДНК (синий прямоугольник на рис. 1, а), признанного специального ДНК между белками (показано в виде четырех синих и серых кружочков на рис. 1, а). В плазмиде также есть ген, который кодирует ДНК-связывающий белок, наряду с «целью» (target) — фрагмент рецептора TnCAD бабочки-вредителя. Поэтому, чтобы начать выражение pIII, белок Cry1Ac, закодированная в геноме фага, должен присоединиться к «белые». Тогда на пришитом к нему фрагмент РНК-полимеразы соберется вся многокомпонентная бактериальной РНК-полимеразы, который находится как раз в нужном месте, чтобы выполнить транскрипцию pIII и производить белок, необходимый для размножения вируса. Наконец, размножиться могут только вирусы, которых Cry1Ac хоть немного придерживается TnCAD. Чем больше отвечают, тем быстрее будут расти вирусов.
Тем не менее, приемник TnCAD так мало похож на естественные Диана токсина Cry1Ac, что последний к нему не прилипает, так что выбор в принципе не за что зацепиться. Попытки использовать его сразу же TnCAD, как белые не увенчались успехом: ни один вирус не смог размножаться. Тогда, авторы изготовили «ступени промежуточный» для синтетической эволюции: модифицированная версия TnCAD, в котором все три аминокислоты были заменены таким образом, чтобы ключ участок белка, признал Bt-токсинов, стала больше похожа на естественный Диана, Cry1Ac.
Это помогло, и 276 часов эволюции (что соответствует одинаковое число поколений, фагов, и поскольку смена поколений у них происходит примерно каждый час) удалось вывести несколько вариантов Cry1Ac, безопасно прилипающих к модифицированному TnCAD. После этой цели, был заменен на обычный TnCAD, и после 252 часов были получены параметры Cry1Ac, эффективно общаться с приемником.
С момента своего происхождения, в новых токсинов Cry1Ac различные 10-12 аминокислотными заменами. Это много: для получения этих белков без помощи ПЕЙС, вручную размножая генов и, удалив белки на каждом шагу, было бы очень трудно.
Тем не менее, это была еще не окончательная победа. Полученные белки связываются с TnCAD, но сохранили ли они свою летальность бабочки-вредителя? Как выяснилось, не. Эксперименты показали, что новые белки, потеряли устойчивость к пищеварительным ферментам гусеницы: они просто-напросто разлагаются в кишечнике и почти не оказывают токсичного воздействия.
Этот результат был ожидаемым. Поскольку в синтетической эволюции отбор шел только на способность Cry1Ac в контакт с рецептором TnCAD, и остальные свойства белков проигнорированы. Чтобы все-таки получить наличные токсина, авторам пришлось «отменить» закрепившиеся мутации по одному и смотреть, как это влияет на токсичность. В итоге выяснилось, что на стадии искусственной эволюции, когда в качестве мишени был использован еще не настоящий TnCAD, и в модифицированной версии, эволюционный, Cry1Ac установлены две аминокислотные замены, которые сделали протеин уязвимой пищеварительных ферментов гусениц. Когда исследователи удалили эти замены (то есть вернули аминокислот в исходное состояние), получился эффективный токсин, который убивает все гусеницы Т и: устойчивы к Cry1Ac и летучих веществ. Летальность нового токсина относительно устойчивого бабочек была сопоставима с токсичностью происхождения Cry1Ac о происхождении бабочек, еще не выработавшим устойчивость к Cry1Ac. Таким образом, приобретенная у вредителя устойчивости удалось успешно преодолеть. Новый токсин убивает только гусениц Т-ни и ряд близких видов бабочек, которые имеют аналогичный приемник, но безвредные для остальных животных.
Исследование показало, что, в вечной битве человека с насекомыми урожая, нам все еще есть, что противопоставить быстрым развитием вредителей. Поставив себе на службу еще более быстрой эволюции вирусов, человечество будет способно, как минимум, на равных участвовать в гонке вооружений эволюционной насекомыми-фитофагами. Вполне вероятно, что теперь производство ГМ-растений с помощью новых инсектицидов в белки можно поставить на поток, что позволит значительно повысить производительность сельского хозяйства во всем мире. Учитывая, что население Земли, уже в середине этого столетия постепенно приближается к отметке в 10 миллионов долларов, значение новой технологии трудно переоценить.
Источник: Ахмед Н. Бадран, Victor M. Guzov, Цин-Хуай, Melissa M. Kemp, Prashanth Vishwanath, Венди Kain, Autumn M. Finance, Artem Evdokimov, Farhad Moshiri, Keith H. Turner, Настольный Ван, Томас Malvar & David R. Liu. Continuous evolution of Bacillus thuringiensis toxins overcomes insect resistance // Nature. В 2016 году. Ст. 533. Стр. 58-63.
См. также:
1) Трансгенный хлопок помог Китай крестьянам победить опасного вредителя «Элементы», 20.09.2008.
2) Насекомыми-вредителями, защищенных от биологического оружия, «Элементы», 08.10.2007.
3) C. S. Чуб. Растения-ГМО.
4) А. Ю. Панчин. ГМО — мифические опасности.
Александр Марко